Изучение вирусов с помощью атомной силовой микроскопии

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) - это неразрушающий и неинтрузивный метод визуализации, используемый в том числе для сложной структуры микроорганизмов, таких как вирусы, с необычайно высоким разрешением. Используя АСМ, исследователи могут идентифицировать и изучать мембраны, РНК и ДНК, а также белковые комбинации и их подструктуры. Также возможно визуализировать расположение белка в капсомерах капсидов вируса с помощью АСМ.

Обнаружение и визуализация вирусов

Раннее и точное обнаружение вирусов имеет решающее значение для предотвращения дальнейших осложнений и обеспечения эффективного лечения в случаях острых инфекций, таких как коронавирусная инфекция COVID-19. Использование АСМ для обнаружения вирусов играет ключевую роль в эпидемиологических или клинических условиях, в которых чрезвычайно важен быстрый диагноз. Одним из недавних примеров, когда АСМ позволил провести структурную идентификацию интактных вирусных частиц, является эпидемия гриппа H1N1 в Мексике и США в 2011 году.

(а) Отдельный вирион вируса мышиного лейкоза Молони, ретровирус животных, имеющий диаметр около 150 нм. На его поверхности четко видны скопления белковых оболочек. (b) Поверхность вириона вируса коровьей оспы, наибольшее измерение которого составляет от 250 до 300 нм. (в) бактериофаг, заражающий цианобактерии из морской среды. Икосаэдрическая структура капсида и распределение его капсомеров становятся очевидными только при таком увеличении. Компоненты хвостовой части также четко видны. (d) Мимивирус, крупнейший вирус, известный в природе; его поверхность покрыта лесом из тонких белковых волокон с прикрепленным олигосахаридом.

Исследование, проведенное Портером и его коллегами в 2006 году, продемонстрировало способность АСМ и других методов обнаруживать патогены, присутствующие в сложных биологических средах. АСМ позволил визуализировать и анализировать напрямую мелкие вирусы размером около нанометра на гладкой поверхности. Показания микроскопа также помогли оптимизировать субстрат для FCV - кошачего калицивируса, с пределом обнаружения 3 × 10^-6 FCV / мл.

Рост вирусов на инфицированных клетках и необычная морфология некоторых мутантных вирусов также были изучены с помощью топологических 3D-изображений, полученных с использованием этой техники. АСМ также позволяет получать изображения образцов вируса на поверхности клеток на месте, в жидкостях и воздухе или после гистологических процедур.

Современные методы обнаружения и визуализации вирусов

В настоящее время для визуализации морфологии вируса широко используются два ключевых метода: электронная микроскопия (ЭМ) и рентгеноструктурный анализ.

Дифракция рентгеновских лучей позволяет получать изображения структурных деталей на атомном уровне с очень высоким разрешением, а в некоторых случаях может даже демонстрировать взаимодействие между белками и нуклеиновой кислотой. Однако при использовании этого метода для изучения структуры вируса существуют некоторые ограничения.

Во-первых, перед применением этого метода необходимо кристаллизовать вирус, что невозможно при изучении вирусов со сложной, асимметричной структурой. Большие вирусы (диаметром более 1000 Å) не могут быть изучены с помощью дифракции рентгеновских лучей. В результате этот метод может быть применен только к небольшим вирусам, имеющим симметричную структуру, хотя он может быть объединен с другими методами, такими как ЭM или АСМ, чтобы обеспечить более точные результаты.

Электронная микроскопия (ЭМ) используется для анализа вирусных структур двумя способами: трансмиссионная ЭМ и криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ). В трансмиссионной ЭМ изображения вирусов или инфицированных клеток на субстратах получают после тонкого среза, а в криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) несколько изображений частиц с низкой дозой восстанавливаются. За прошедшие годы криоэлектронная микроскопия была усовершенствована с использованием сложных математических методов для анализа изображений в малых дозах.

Передача ЭМ включает обезвоживание, фиксацию и окрашивание тяжелых металлов с целью повышения контрастности на изображениях, что является основным недостатком использования этого метода. Крио-ЭМ также имеет некоторые недостатки, он в основном используется для изучения небольших вирусов с икосаэдрической симметрией и дает «среднюю» структуру, а не индивидуальную.

(а) Вирион коровьей оспы, который был высушен и просканирован на воздухе. Тело вируса, сокращаясь, отошло от внешней мембраны, которая остается на слюдяном субстрате в виде непрерывного палисада. (b) Икосаэдрическая головка и часть хвостового узла цианофага. (c) Вирион мимивируса, густо покрытый кластерами гликопротеиновых волокон. (d) Поверхность кристалла вируса бромовой мозаики. (e) вирион вируса иммунодефицита человека с характерными кластерами белка оболочки (gp 120), распределенными по явно произвольной схеме по его поверхности. (f) Большие треугольные пластины, собранные для создания капсида PBCV-1, большого (диаметром 200 нм) икосаэдрического иридовируса, поражающего водоросли. Регулярное сотовое расположение капсомеров на поверхности видно даже при довольно небольшом увеличении.

Тем не менее, крио-ЭМ можно сделать более мощным, комбинируя его с другими методами, такими как дифракция рентгеновских лучей, хотя следует проявлять осторожность при анализе комбинированных результатов, поскольку оба метода дают статические и «средние» изображения структуры.

По сравнению с дифракцией рентгеновских лучей и ЭМ, АСМ и крио-АСМ являются весьма перспективным методом. Основным преимуществом такого микроскопа является его простой физический принцип работы. В отличие от других методов, он недорогой в установке и применении для использования на биологических образцах, поскольку имеет небольшие размеры.